靈芝形態、菌種分離、人工栽培技術與菌種保存技術

陳啟楨博士

1. 前言

靈芝作為藥物在中國已有五千年悠久的歷史,歷代著名之本草書籍均記載有關於靈芝的敘述,例如東漢時期雍仲淳所著之「神農本草經」至明代(1590)李時珍所著之「本草綱目」等,可久食輕身不老,延年神仙。近年來各界一直嚐試以科學的方法來闡釋記載於本草綱目中靈芝的藥效,例如分析其化學成分、研究其藥理作用及進行臨床試驗等團體性之研究工作,旨在將靈芝神話加以明朗化,並得以輔助現代醫藥學的進展。然而,靈芝在它神奇療效的另一面,有一點值得注意的,便是西方國家反而較重視它與樹木之間的關係;靈芝屬普遍分布世界各地,寄主非常廣泛,自闊葉樹到針葉樹,甚至竹類、椰子、檳榔、油棕與葡萄都會受其侵害。它所分泌的細胞壁分解酵素對植物細胞具有很強的軟化作用,造成木材腐朽及根部腐朽。常見的闊葉樹,如相思樹、楓香、合歡、鳳凰木、木麻黃、柑桔和竹類等都受其危害。

2. 基礎分類

2.1. 菇的形態

食用菇大部份屬於擔子菌綱(Basidiomycetes) 而少部份屬於子囊菌綱(Ascomycetes) ,其分類與鑑定仍以傳統形態觀察為主。形態觀察必須配合其生活史,典型的擔子菌生活史包括有性世代及無性世代,有性世代是在子實體核配後經減數分裂產生擔孢子的階段,無性世代則是指同核體菌絲時期產生芽孢子或在異核體雙核期產生節生孢子,不過產生無性孢子的頻率並不高,其生殖繁衍最主要還是產生擔孢子的階段。鑑定是一件複雜的工作,須具備相當的真菌學基礎。鑑定時應把子實體的全部特徵詳細記錄及照相存檔,隨後將標本乾燥保存。擔子菌的子實體大部份以雨傘狀為基本型態,但也有例外,如木耳、白木耳等異擔子菌類 (Heterobasidiomycetes) 。一般菇類傘狀部分稱為菌傘 (cap) ,柄部稱為菌柄 (stipe) ,柄上有菌環 (veil),菌柄下部腳苞部分稱為菌托 (volva) 。傘上的斑點稱為鱗片 (scale),突起的稱為疣點 (warts),傘下面的褶狀物稱為菌褶 (gill) ,也有管狀 (tubes) ,或齒狀 (teeth) ,菌蓋內為子實層(hymenium)。例如香菇、洋菇、金針菇、草菇、鮑魚菇等。另外也有些多孔菌類,通常無柄或者有柄時,傘面下之孔狀沿著菌柄垂生下來,這類菌大多是質地堅硬,如靈芝等,但也些質地柔軟的,如牛排菇等。

子囊菌類的子實體變化較多,但並不呈雨傘狀。其子實體稱為子囊果,內藏有子囊,子囊內通常有八個子囊孢子。一般常見的如馬勃、冬虫夏草等皆是。

食藥用菇的主要營養類型,可以概括分為三大類:腐生性、寄生性和共生性。絕大多數食藥用菇都是腐生菌,它們不僅在食物鏈中扮演分解者的角色,使自然界中的物質得以轉化並依序循環,且為人類提供了珍貴的食品與藥用有效物質。食藥用菇中只有一小部份屬於弱寄生或兼性寄生,例如,靈芝。而有不少的食藥用菌根菌則是與高等植物 (特別是木本植物) 發生共生關係,例如,松茸和美味牛肝菌。若以生長基質種類來加以劃分,則菇類的生態特性可區分成三類:

A.木生菌:以木材為其營養基質,分解利用木材的纖維素和半纖維素或木質素,導致木材褐腐或白腐,部份會具有植物弱病源性能力。例如,香菇、鮑魚菇、茯苓和猴頭菇等。

B.土生菌:以土壤和地表腐植質為營養基質,部份會與植物的根系形成共生關係。例如,竹蓀、羊肚菌、四孢蘑菇、美味牛肝菌、松茸等。

C.蟲生菌:繁殖生長在昆蟲體上,或與昆蟲的活動有著密切的聯繫。例如,冬蟲夏草毒生磷翅目蝙蝠蛾屬的冬蟲夏草蛾幼蟲。

  大自然的生態系中,食藥用菇類在早期的研究中被發現扮演著腐生者和寄生者的角色,常常被認為是植物病害的始作俑者,後來人類在植物根部發現的共生菌中亦常有食藥用菇類的出現,從此之後人們才知道菇類在食物鏈中亦扮演著共生關係的積極性角色。人類從知道自野地採擷野生菇到西元六百年左右,木耳是第一個被人類成功栽培的食用菇 (Chang等,1993),隨後先人陸續利用克難式的方式將野生菇搗碎灑於或塞於砍划的木頭上,遂逐漸培養出其他菇類,如香菇等。二十世紀以來,食用菇漸漸成為人們喜愛的食物來源與保健素材,法國人更於一次大戰其間無意中發現栽培洋菇的方法,演變至今洋菇已成為世界上生產量最大的種類。在台灣地區,依據食藥用菇類的生長習性,其栽培方法大略可分為四種 (劉,1997) (1) 段木栽培法:如木耳及香菇; (2) 太空包栽培法:如靈芝、雲芝、鮑魚菇、木耳、香菇及杏鮑菇 (Pleurotus eryngii) 等; (3) 機械自動化控溫栽培法:最典型的代表如金針菇 (Flammulina velutipes),其次如柳松菇 (Agrocybe aegerita),猴頭菇及杏鮑菇等; (4) 覆土法:常見的有洋菇 (Agaricus bisporus) 及草菇等。

2.2. 靈芝分類之主要依據性狀

  靈芝又名瑞草、神芝、萬年蕈、赤芝等,自古以來在中國人心目中象徵著吉祥,並為中國醫藥中珍貴的藥用真菌。在分類學上隸屬於菌類界,真菌門、擔子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、靈芝菌科(Ganodermataceae)、靈芝屬(Ganoderma)(Ainsworth et al., 1973)

  神農本草經有六芝的記載,即丹芝(赤芝)、玄芝(黑芝)、龍芝(青芝)、玉芝(白芝)、金芝(黃芝)、木芝(紫芝)。明朝李時珍的本草綱目裡仍收上列六芝,收入菜部歸為菌類藥物。六芝的區別,主要以其顏色、外形和大小而分,並未考慮其顯微鏡下的微細構造及其它生理、生化學的特徵,故於分類系統上六芝之真正學名仍是未知數,比較肯定的是其中的赤芝可能指的就是目前市面上所售的赤芝(Ganoderma lucidum)或松杉靈芝(Ganoderma tusgae)。至目前為止,經共同認定之靈芝屬真菌的特徵有:

1) Gano=亮,derma=皮;即子實體具有光亮的表皮(Karsten, 1881),因菌蓋有漆狀分泌物(laccate)

2) 利用木材之木質素(lignin)與纖維素(cellulose),使枯死的木材呈白色型腐朽,故靈芝是屬於白腐真菌的一種。

3) 擔孢子卵形,具雙層壁:內壁暗黃褐色,其上著生疣狀小刺;外壁透明無色、較薄,被覆於內壁表面之疣狀小刺外圍。擔孢子的頂端較厚,成熟後其頂端經常成截頭(truncate)

4) 子實體的菌絲系統為三次元(trimitic),分別為生殖菌絲(generative hyphae)、骨骼菌絲(skeletal hyphae)和結合菌絲(binding hyphae)

5) 會分泌漆化酵素(laccase)和過氧化酵素(peroxidase)

6) 菌種於洋菜培養基中培養時,菌落中具有橢圓形無內含物的角質化細胞(cuticular cell),部份菌種並會產生厚膜孢子(chlamydospore)

3. 靈芝的菌種分離與培養

靈芝乃我國發現最早之名貴藥材、藥效最廣泛之上藥,因此自古以來便一直被研究,希望能以人工栽培來大量生產,直到1972年純菌種培養的技術成熟後,利用段木栽培方式才正式由野生馴化成人工栽培模式。而近十五年來菇農採用木屑進行太空包的方法栽培,使得栽培的收成量及品質增加,更加速了靈芝的市場開發。

3.1. 無菌的概念和純菌種的培養

在食用菇栽培中,菌種的優劣會直接影響產量的高低。優良菌種包括兩個含意:一是指菌種本身的種性,如高產、優質、抗逆性強;二是指菌種純度高、無蟲、無雜菌污染。因此菌種之製作應選用優良品系,掌握菌種製作技術,以提供優良的原種、母種和栽培種。在此針對第二點,分成無菌的概念和純菌種的培養兩方面,來做詳細說明。

3.1.1. 無菌的概念

在菌種製作時,必須避免雜菌之共存,才能達到純粹培養 ( pure culture ) 之目的,所以製作無菌培養基及防止空氣中微生物之混入,是最重要之操作。為達前者之目的,器具及培養基必須經過殺菌;為達後者之目的,瓶口或管口應塞棉花以與外界雜菌隔離,且移植培養操作需於無菌箱或無菌室內進行。

3.1.1.1. 製作無菌培養基

3.1.1.1.1. 消毒與滅菌

自然界中存在著各種微生物,人們為了培養利用有益微生物,消滅或抑制有害微生物之活動,不斷發展消毒滅菌技術。根據對微生物的殺滅程度,可以分成三個等級:

A. 滅菌--是徹底殺菌,即用物理或化學等方法,殺死物體上的一切活的微生物,包括他們的芽孢或孢子,使物體成為無菌狀態。

B. 消毒--是非徹底殺菌,即用物理或化學等方法,殺死物體上的有害微生物。

C. 防腐--是抑菌過程,即用物理或化學等方法,防止或抑制微生物的生長繁殖。

3.1.1.1.2. 加熱滅菌

利用高溫殺死微生物的方法稱為加熱滅菌,當高溫作用於微生物細胞時,首先引起微生物細胞內原生質膠體的變性、酵素結構的破壞,從而使細胞失去了生活機能上的協調、停止生長發育,隨著高溫的繼續作用,細胞內原生質便發生凝固、酵素結構完全破壞、活性消失、生化反應停止、滲透交換等新陳代謝活動消失,細胞立即死亡,這就是高溫滅菌的基本原理。加熱滅菌是最普遍採用的方法,因為它經濟有效,簡便易行。它可以分為溼熱滅菌和乾熱滅菌兩種:

3.1.1.1.2.1 溼熱滅菌

利用蒸汽或沸水滅菌稱為溼熱滅菌,由於溼熱滅菌的穿透力比乾熱滅菌大、殺傷力強,蛋白質原生質膠體在溼熱條件下容易變性凝固,酵素系統容易被破壞,蒸汽進入細胞內凝結成水能放出潛在熱量,而提高溫度更增強了殺菌力,常用的溼熱滅菌方法有如下幾種:

3.1.1.1.2.1.1. 高壓蒸汽滅菌法

利用高溫高壓蒸汽進行滅菌的方法。高壓蒸汽滅菌可以殺死一切微生物,包括細菌的芽孢、真菌的孢子或休眠體等耐高溫的個體,滅菌的蒸汽溫度隨蒸汽壓力增加而升高,增加蒸汽壓力,滅菌的時間可以大大縮短,因此它是一種最有效的,使用最廣泛的滅菌方法。

3.1.1.1.2.1.2常壓蒸汽滅菌法

採用自然壓力的蒸汽進行滅菌的方法。阿諾氏(Arnold)流通蒸汽滅菌器是微生物技術中常用的設備,流通蒸汽的溫度一般為100℃左右,此方法最大的優點是容量大、結構簡單、成本低廉、可自行建造;缺點是滅菌時間長、能源消耗大,稍不注意就有滅菌不徹底的現象發生。

3.1.1.1.2.2. 乾熱滅菌

採用灼燒或乾熱空氣滅菌,雖然乾燥高熱空氣的穿透力不如溼熱蒸汽強,但它使用方便,適用於玻璃器皿和瓷器等物之滅菌。

3.1.1.1.2.2.1. 火焰滅菌法

通過火焰高溫灼燒進行滅菌之方法。接種環、接種針、試管口、玻璃瓶口等,通過幾次火焰,溫度可達200℃以上,一切微生物和芽孢可全部殺死,達到滅菌程度。

3.1.1.1.2.2.2.乾熱滅菌法

即利用加熱之高溫空氣進行滅菌的方法。乾熱烤箱是乾熱滅菌常用之儀器,它是通過電熱絲進行加溫和調溫的,不僅可以用來滅菌,也可用於器皿等材料的烘乾,適用於固體材料滅菌,不適用於液體材料滅菌,一般使用溫度為160℃,維持兩小時。

3.1.1.2. 純菌種的培養

3.1.1.2.1. 自然界中的雜菌污染

菌種生產是在嚴格的無菌條件下,培養繁衍某一特定菌類的過程,曾有人統計在1g穀粒中含有43000-108000個細菌,228個放線菌,12000個絲狀真菌和大量的酵母,因此生產1g純菌種至少要殺死100000個微生物,穀粒菌種如此,糞草菌種、河泥菌種等培養基內所含微生物的數量則更多。

從變質菌種中分離出來的微生物簡單介紹如下:

3.1.1.2.1.1. 細菌

細菌在自然界中種類繁多,在原種生產中,由於操作不仔細而污染,就能看到各種細菌菌落,細菌菌落較小,多數表面光滑、溼潤,半透明或不透明,有些還具有各種顏色,但也有些細菌菌落表面乾燥,並有皺褶,它的個體形態有桿狀、球狀或弧狀。

從變質的穀粒菌種中分離出來的細菌,多是一類經消毒後還存活的抗熱性細菌,最常見的有枯草桿菌黏液變種(bacillus subtilis var. mucoides)和蠟狀芽孢桿菌黏液變種(bacillus cereus var. mucoides),這兩種細菌均為格蘭氏陽性,含有芽孢,並產生黏液的好氣性細菌,在穀粒菌種中開始發生於穀粒的接觸點或穀粒與瓶壁的接觸點,經過一段時間就出水形成濕斑,在穀粒間污染很快,搖瓶時更快,穀粒通常變軟,變成暗黑色或黑色、灰色、橙黃色,柔軟帶黏液,溢出臭味。

3.1.1.2.1.2.放線菌

在瓊脂培養基上,放線菌菌落形態與細菌菌落有明顯的差異,其菌落大小介於細菌與黴菌之間,菌落表面多為緊密的絨狀,堅實多皺,長孢子後就成粉末狀。如引起蘑菇菌種變質的放線菌大多是鏈黴菌的白色系(Streptomyces series albus),放線菌污染不是大批污染,而是各別瓶出現不正常的特徵,例如常在瓶壁出現白色粉狀斑點,若不仔細觀察常易誤認為是石膏的粉斑,或出現白色纖細的菌絲,很容易與接種的菌絲相混淆。有幾個特點可用來將兩者加以區別,發生放線菌污染時有些種的白色菌絲大量吐水,有些種的白色菌絲形成乾燥發亮的膜狀組織,有些種會交織產生類似子實體樣的結構,多數會產生土腥味。

引起菌種變質常見的放線菌有白色鏈黴菌(Streptomyces albus)、濕鏈黴菌(Streptomyces humidus)、鏈黴菌(Streptomyces sp.)、諾卡氏菌(Nocardia sp.)。

3.1.1.2.1.3.酵母菌

酵母菌是一類單細胞的真菌,大多數種類一般不形成真菌絲,酵母在空氣和土壤中較少,它一般生長在含糖高又帶微酸性的環境裡因此在水裡、蔬菜、穀粒、菇類的子實體上很容易找到,酵母菌的菌落與細菌很相似,菌落表面光滑、溼潤、有黏稠性,不同的是酵母菌落大多數是乳白色的,少數粉紅色,其菌落一般比細菌菌落大而厚。

最普遍引起麥粒菌種變質的酵母有紅酵母(Rhodotorula rubra)橙色紅酵母(Rhodotorula aurantica)黑酵母(Aureobasidium pullulans

3.1.1.2.1.4.黴菌

黴菌是一類單細胞或多細胞的絲狀真菌,分布很廣,空氣中有大量黴菌孢子,遇到適宜的條件就萌發長成新菌絲,它對營養條件要求不嚴格,很容易在各種物質上生長,造成「發霉」現象,因此它引起菌種變質的百分率最高,黴菌的菌絲比前三類大,成絨毛狀或疏鬆的棉花狀,並有各種顏色,在菌種生產上常以菌落的顏色來辨認它們,俗稱綠黴、黃黴、青黴和紅黴。

3.1.1.2.1.4.1. 青黴(Penicillium spp.

青黴污染時,到處產生薄薄一層淡藍到綠色粉末,青黴生長不快,但有些能抑制食用菇菌絲的生長。

3.1.1.2.1.4.2. 木黴(Trichoderma spp.

木黴生長比青黴快很多,其分生孢子為綠色,是與青黴區別之處,木耳木屑生長中造成嚴重污染者,不是青黴而是木黴,木耳栽培塊感染上木黴後,如果溫度在20℃以上,很快會傳染開來,而導致栽培失敗。

3.1.1.2.1.4.3. 曲黴(Aspergillus spp.

菌種生產上俗稱的黃黴菌,大多是曲黴屬。

3.1.1.2.1.4.4. 毛黴(Mucor spp.)和根黴(Rizopus spp.

俗稱長毛菌,開始菌絲稀疏細長,生長迅速,木屑菌種中25℃左右,7-10天即可發到瓶底,在瓶表面形成很厚的白色菌絲團,幾天後變成灰黑色,在瓶中到處出現細小黑色的分生孢子囊。

3.1.1.2.1.4.5. 麵包菌(Neurospora spp.

造成菌種大量污染的紅色孢子群之主要污染菌,其菌絲初為白色,逐漸變成紅色,後期變成橘紅色粉狀孢子,如果消毒時棉塞受潮,它能透過棉塞伸入菌種瓶中,在培養室內發現此菌後,應及時處理,否則不到2-3天就會傳遍整個培養室。

3.1.1.2.2. 引起雜菌污染的原因

A. 培養基消毒不徹底。

B. 母種帶染。

C. 接種污染。

D. 培養室及周圍環境差。

3.1.1.2.3.防止雜菌污染的措施

A. 滅菌要徹底。

B. 培養基原材料要新鮮,米糠等物發現黴變、結塊不宜使用。

C. 滅好菌的瓶子要放在乾淨的冷卻室內冷卻,移入接種室前要做好表面消毒。

D. 接種室或接種箱消毒要徹底。

E. 接種時室內空氣要保持相對靜止。

F. 母種應採用活力強、菌齡適宜、抗逆性強之優良菌株,絕對避免用病蟲侵入之母種。

G. 培養室應設在乾燥通風,周圍環境乾淨的地方。

3.2. 菌種之分離培養

3.2.1. 分離工具:

A. 工具:解剖刀、尖的鑷子、接種針、70%酒精、瓦斯噴燈等應事先準備齊全,尤其是解剖刀、鑷子、接種針在使用前務必以火焰反覆燒至殺菌完全。

B. 培養基:應先配製好適合分離培養菌種的培養基備用,例如PDA培養基,以便於要使用的時候能隨時取用。

C. 欲分離菌種前才摘取新鮮的菇體進行分離。

3.2.2. 菌種分離方法:

A. 將欲取用菌肉的工具,如解剖刀、尖的鑷子及接種針分別在瓦斯噴燈上以火焰燒紅後,淬入70%酒精冷卻,再燒紅後再冷卻,如此反覆至少三次,最後一次燒紅浸入酒精後,稍為在火上晃一下,使殘留的酒精燃燒後,稍涼即可使用。切記:勿在解剖刀等工具還很燙的時候取菌肉,否則菌體會被燒死。

B. 將菇體用手從菇傘中央輕輕剝開,絕對避免使菌傘表面或手或其他地方碰到剝開的菌肉,以免雜菌污染。

C. 以殺過菌的解剖刀輕輕在菌肉中央割幾個方塊,然後用尖的鑷子或接種針取下一塊菌肉放入培養皿或斜面試管中,也可直接以尖的鑷子夾起一塊菌肉放入培養基中,使菌肉直接接觸到或者最好半插入培養基,然後封起來於恆溫中培養。接種工具以接種一次為原則,若覺沒有碰到任何可能污染的地方,則可多接種一兩次,若有碰觸到除了培養基以外的其他地方,則應重新燒過殺菌後再行取菌肉,以減少污染。記住:每一個培養皿或試管應個別寫上編號,並且在記錄簿上記錄分離時間及編號,以利將來試種後追蹤產量最高的菌種。

D. 分離後之試管或平板應放置於恆溫箱中培養,觀察菌絲是否從菌肉中長出及觀察有無其他細菌或黴菌污染,若只從菌肉中長則持續觀察至開始旺盛時(亦即剛長出時生長速度慢,但幾天之後突然生長速度變得很快,則表示進入旺盛時期),此時即可進行大量的繁殖。

4. 靈芝的栽培技術

台灣屬於海島型國家,其北半部屬於亞熱帶氣候,南半部則屬於熱帶氣候,一年當中以11月至來年3月之平均溫度最低,但是,亦在15℃以上,4月以後則除了高地之外,均在20℃以上,其中又以6月氣溫最高,約都在30℃以上。由於台灣地區地形複雜、氣候型態差異性較大,所以,適合栽培之食用菇種類也較多,目前商業化品系已超過十種以上,靈芝是較常見之木生菇菌之一,其栽培方法主要為太空包栽培法,以下就其栽培方法作一敘述。

4.1. 母種:

在無菌條件下,取新鮮靈芝的菌蓋或菌柄內部組織(或孢子)一小塊,接種在斜面培養基上,在25℃下加以培養,當白色菌絲長滿培養基斜面時,母種即告成功。

4.2. 麥粒及木屑大量菌種的製備

製備大量的菌種供太空包使用,通常須經過三道的增殖手續。

第一步驟、將分離出來的旺盛時期菌種再經培養皿的大量繁殖:從剛分離或液態氮保存活化的菌種取一小塊洋菜菌絲塊,移入新鮮的培養基中於恆溫室繼續培養,要接多少個培養皿則視所要做的菌種多寡而定。待菌種再生長至旺盛時,進行第一步驟。

第二步驟、將大量繁殖好的培養皿菌種,接種到殺過菌的麥粒或木屑太空包中,然後移入恆溫中培養,所需要的量則視第三步驟要接多少麥粒或木屑菌種而定。以上兩個步驟皆應在無菌操作台上操作,因洋菜培養的營養豐富,容易引起污染,故不宜在無菌操作台以外的地方操作。

第三步驟、待麥粒或木屑菌長滿時,去除最上面較老的菌絲塊,然後即可大量接種到太空包中。切記:每一個菌種編號必須接種時同時抄入新的培養皿或太空包中,以利將來的追蹤調查其產量。

註:記錄每一個培養皿能接幾瓶菌種以每瓶菌種能接幾個太空包,如此反算回去每回要做多少太空包需要原種接多少個培養皿,若欲做的太空包數量太大,則上述三個步驟可增加為四或五個步驟,以減少洋菜培養皿的培養次數所引起的污染機率。

4.3. 培養料的製備

4.3.1. 木屑瓶菌種

鋸木屑〔闊葉樹,以相思樹最好〕

37.5kg

麥麩

12.5kg

硫酸銨

0.1kg

70 %

將鋸木屑、麩麥、硫酸銨摻在一起,攪拌均勻以後,加入適量的水(含水量約為6065),然後裝入1000毫升容量的廣口瓶內,打洞,經過高壓滅菌以後備用。

2. 接種和培養:在無菌條件下,挑取黃豆粒大小的一塊母種,接種在廣口瓶內培養的肩部,塞好棉塞,在27℃下加以培養,經過十五至二十天,當白色菌絲長滿全瓶時,即成為栽培種了。

4.3.2. 麥粒菌種瓶

將麥粒浸泡半天到一天之後,以煮飯的方法煮至麥粒熟了,但麥粒之皮膜不要破裂,且縱溝仍可依稀看到未煮熟的樣子為最適合條件。煮熟後以電風扇稍為吹涼,並使麥粒表面不要殘留太多的水份,之後加入約1-2%的碳酸鈉,以調整pH值至6.5-7.0左右,然後裝入塑膠瓶中,塞入棉花塞,滅菌冷卻後即可接入母種,以便當為栽培用菌種。

由於麥粒是很營養的培養基,故較合冬天製備使用,若是夏天則應利用空調(22-25)培養為宜,以免高溫下造成細菌及其他青黴菌等污染。

4.4. 太空包栽培法:("Bag log" Cultivation)

3.3.4.1. 材料

製作木屑太空包用來栽培食用菇的材料,主要是木屑,補助材料為米糠、粉頭或玉米粉及碳酸鈣等,一般所採用的配方比例如下:

 

 

 

材料名稱

乾木屑

堆積過木屑

(不含水份計)

容積比

(含水50%)

柯木屑

100公斤

100公斤

100

米糠

8-16公斤

4-8公斤

4.5-9

粉頭或玉米粉

4-8公斤

2-4公斤

1.5-3

碳酸鈣(石灰)

0.6-1.0公斤

0.3-0.5公斤

0.6-1.2

180公斤

40公斤

60-70%左右

備註:以上三種比例調配方式皆相同,最後之含水量約60-70%,所需要水量適木屑乾燥的程度而定,一般說法是配後用手抓一把使力後能微微部分水份從指縫流出來大約便是60-70%了。

各種材料的使用應注意下列事項:

A. 木屑:可採用乾燥堆積半年以上,使用時再加水處理,若是使用之木屑全為單一木屑,則可在加水堆積三至五天後即可配料使用,若混有不良之雜木屑,則應酌量增加堆積時間,一般至少15天以上。

B. 米糠及粉頭或玉米粉:米糠必須是新鮮的,存放過久則因發酵變酸不宜使用,其用量則視所種菇種而定,據說100公斤的乾木屑中加人24公斤的米糠可以得到最高的產量,而金針菇則木屑與米糠以1:1的比例混合產量最高,而且收獲時間縮短。不過,米糠的含量愈多,則栽培上發生雜菌污染的機率也愈大。

C. 碳酸鈣:也就是我一般俗稱的石灰,香菇較適酸性pH值在4.55.5之間生長最好,所以碳酸鈣不宜加太多,以免阻礙生長,根據試驗100公斤的木屑加入0.66公斤的碳酸鈣,其經濟效益最高。

D. 水:木屑之含水量依木屑種類及堆積時間不同而有相當大的差異,一般在調配後裝袋前,用手緊捏手把木屑材料,若自指間稍有水分滲出即可,以含水量表示則以60%最適宜。

4.4.2. 製作過程

4.4.2.1. 材料過篩:

一般鋸木屑往往會摻雜小木塊及較尖硬雜物,若不過篩清除,則將來裝入塑膠包時可能將塑膠袋刺破而增加雜菌污染機會。

4.4.2.2. 材料混合:

依上述配方均勻混合。

4.4.2.3. 裝袋壓包:

混合之材料,裝入P.P.塑膠袋中壓緊,使高度達18公分,並在中心打一個直徑1.5公分,深10公分之洞,以利於殺菌後之接種及通氣,壓包完成後在袋口處裝上一個P.P.塑膠瓶頸,並塞妥棉栓放入籃內等待殺菌,殺菌前最好在太空包籃子上蓋一層塑膠布,以免殺菌後取出來時,水蒸氣凝結於棉花塞,易增加污染機會。

4.4.2.4. 殺菌:

一般殺菌方法可分為二種,一為蒸氣殺菌法,一為高壓殺菌法。

A. 蒸氣殺菌法:在殺菌釜內通入水蒸氣,溫度約95-100℃,維持四至六個小時,然後停止送入水蒸氣,待殺菌釜內溫度降至50-60℃時,取出冷卻至30℃,迅速接種。

B. 高壓殺菌法:殺菌釜是採密閉式,所以內部水蒸氣因壓力上升而能使水蒸氣溫度達到121℃,維持1.5-2小時殺菌後,待釜內溫度降至60℃即可取出再冷卻至30℃左右,迅速接種。

4.4.2.5. 接種:

將棉花塞拔開,立即加入一些新鮮無雜菌的原種,接種時應緊量避免可能的污染機會,例如手應用肥皂洗過並以70%酒精擦拭,原種瓶及接種工具都應消毒過,接種室內也應維持清潔,最好在接種前一天即予以消毒。

4.4.2.6. 培養:

將接種完之太空包移入培養室培養,使其菌絲得以順利生長,至於培養溫度及濕度則視菌種不同而異,通常濕度不宜太高,否則容易滋生雜菌,太低則太空包容易乾掉,一般維持60%相對濕度即可。至於培養溫度,如香菇則在15-25℃適宜生長,柳松菇則在15-30℃下皆可生長。

4.4.2.7. 開包:

待菌絲生長差不多時,則可將棉花塞拿掉甚至於塑膠包自頂部切平,如香菇的菌絲長滿太空包之後還得待菌絲由白轉為褐色才能開包,又如鮑魚菇及柳松菇則待菌絲長滿整個太空包即可去掉棉花塞。此時通氣量要夠,而且相對濕度必須維持85%-95%之間,否則剛長出來的菇蕾會乾掉無法持續生長。開包後若是日夜溫差大,則較容易刺激出菇,而且產量也較大。

4.4.2.8. 管理:

4.4.2.8.1. 隨時檢查接種後的太空包是否受到細菌或黴菌的污染,一般細菌污染則太空包底部會有浸水狀,若是黴菌污染則很容易看到雜菌的出現,尤其是青黴菌及木黴菌最為嚴重,若有污染的太空包應儘速挑出殺菌丟棄。

4.4.2.8.2. 菇舍應保持乾淨,每次換批時,應徹底消毒過,這樣可以增加下一批的成功率,減少雜菌污染。

4.4.2.8.3. 採收完後之廢棄太空包應殺菌後再行處理,處理方式為重視環保,應將塑膠袋取出,廢木屑則可當田間之堆肥用或者當燃料,千萬不可隨意載到路邊丟棄。

5. 食藥用菇類菌種保存法

5.1. 引言

菇類菌種是農業上重要的生產菌,世界各菌種中心莫不把菇類菌種列為保存的重點之一,如美國菌種保存中心(ATCC)、英國國家微生物研究中心(CMI)、荷蘭真菌保存中心(CBS)、日本大阪醱酵研究所(IFO)、美國農部北區研究中心(NRRL)等皆保存有相當數量的菇類菌種。在農業、製藥及發酵工業上,環保菌株、生產菌株、接種源及分析用菌種之保存,均是非常重要的事,尤其是可信賴的優良母株,對於微生物利用工業而言,是絕對必要的,故保存微生物的方法很早就受到相當的重視(Martin, 1964)。不管是農業、醫學、工業、食品等所使用的微生物,不僅要鑑定完善,而且必須在接種過程中,維持菌株特性之安定,如以慣用之定期繼代接種方法,在保存和製造種源時,其遺傳上的安定性較難控制(Lincoln, 1960),所以必須有一種穩定的保存方法,才能確保優良菌種的遺傳特性。

由於菇類菌種的細胞核分裂速度快,且易受環境改變的影響,自然突變的機率大,若未能適當保存,常會發生退化及變異現象而失去其原有之優良特性而降低其生產量及品質,造成栽培者重大損失及食品市場來源不穩定之困擾。民間常用的礦物油保存雖可短時間保存菌種,具有防止污染及避免乾燥之優點,然其穩定性差,一旦寶貴的菌種發生突變或死亡,所造成的損失將無可彌補,所以必須有一套完善的保存制度方是長久之計,任何先進國家成立菌種保存中心之理由亦是在此。因之,如何保存其遺傳之穩定性實為重要之課題。

導致基因重組和突變的有絲分裂,與細胞的分裂及代謝活力有關,一個理想的基因種原保存是應在代謝被不活化的狀態下,將活的菌體控制維持其活性,亦即製止其細胞的分裂與停滯其生長 (Jong and Davis, 1987),此一目標已用超低溫保存方法發展成功,並為長期保存食用菌類的最好方法 (Jong, 1978 & 1987)。在諸多的冷凍劑中,如液態空氣、氫、氦及氮中,以液態氮被認為是最安全及最符經濟效益的 (Jong, 1987),然在超低溫凍化過程中,由於水分的傳送均經過細胞膜,冷凍時細胞內冰晶的形成刺傷胞膜與胞內溶質濃度增高,容易導致凍害。控制適度降溫速率可提高細胞存活率,為能降低在凍結及解凍時所發生的冰晶傷害程度,採用適當的化學保護劑,可以減少冰晶的形成。目前已有很多的化學化合物曾被單獨或混合使用為冷凍保存菌種的抗凍劑,這些抗凍劑能控制冰晶的大小及形成速率,能緩和溶質的濃度的急速增高及增加細胞膜的水滲透性,並降低細胞內容物的凝結點,以利冷凍時細胞脫水的進行。抗凍劑有兩大類型,一為浸入型,如甘油及DMSO等,此等溶液能滲入細胞內,而得以胞內及胞外同時發揮其保護效果;二為非浸入型,如糖類及PVP等,用於使胞內胞內於冷凍時與水分子產生結構上的改變與細胞內溶質濃度的平衡,避免脫水過度。

冷凍乾燥法是優良的菌種保存方法,能夠維持菌種的穩定性,通常適用於細菌、酵母菌及能產生孢子的黴菌,但對於只有菌而不會產孢的黴菌及菇類真菌而言是不能適用的,因此凍乾法對於菇類真菌來講是有限制的。由於精液及血液能成功地保存於液態氮中,啟發了真菌或許也能利用此一方法來保存的構想。由於此種超低溫保存法能減少細胞內外的液態水而使許多生理作用不能進行,並能防止細胞核的分裂,使細胞發生變異之可能性降低最低,故對菌種中心及相關研究是最重要的方法。

菇類之研究領域現已逐漸成為世界各國研究發展為高經濟科技及學術探討之對象,故無論在採集、鑑定、分離、複核、栽培、形態、生理生化分類及長期保存菌種上皆具重要性。菇類在分類上是屬於擔子菌及子囊菌之高等真菌,在農業、醫學、工業等研究範疇中具有相當重要的地位及研究潛力,但是若無法妥善保存菌種,則將導致菌體的變異或退化,使其失去其原有優異的遺傳特性,或降低活性甚至死亡,均將嚴重影響其經濟效益及研究價值,故知長時間保存菌種時應採取適當之措施以防止變異發生。因此,菌種保存工作在科學發展領域上扮演著舉足輕重的角色。菇類自古與中國人之食性有密切之關係,例如香菇、洋菇、草菇、木耳等至今仍為我國甚至於全世界各國人民所喜愛的食品。就保存與銷售方面而言,菇類因屬真菌,在培養基上採菌絲培養是最直接簡便之方法,不過因菌體在培養基上極少產生孢子,不適用於冷凍乾燥法長期保存菌種。若是收集子實體之擔孢子或子囊孢子,雖可利用冷凍乾燥法保存,然因子實體產生之孢子在採收時已曝露在空氣中,尤以野生採集為然,極易受到污染,故在活化接種時必須採用單孢分離,而且必須正負兩個品系交配,所以雖然能確保長久保存的成功率,但因操作繁瑣,只有少數學者研究某特定之屬,且為了雜交育種之便才被採用,以菌種保存中心而言,此法難以被採用。

理想之基因種源保存是制止細胞分裂及停滯其生長使其生理代謝完全停止活動。由於食用菇類絕大多數係以純菌絲生長,在培養基上極少產生孢子。所以,除了能形成節孢子或芽孢子之菌株外,均不適用於凍乾保存。近二十年來已成功地使用超低溫保存法長期保存食用菌類菌種(Jong, 1987; Jong & Davis, 1987)。其中液氮保存係利用液氮液相( -196)及其氣相(-150180)的超低溫,使細胞內外的液態水減少而無法進行生理作用,同時抑制細胞核分裂,防止其變異。而細胞在冷凍解凍的過程中,常因溫度超過-139℃時所形成的冰晶對細胞造成傷害,以致於影響其存活率。因此需配合冷凍解凍速率之控制及保護劑之添加,以減少細胞在液氮保存過程中損傷。目前已知以 1 /min 的速率緩慢降溫冷凍(Hwang, 1966)及以37℃∼40℃快速解凍法(Jong, 1987),並以10%甘油或5%DMSO作為抗凍劑(Jong, 1987; Jong & Davis, 1987)對大部份菇類保護效果較佳,因此液態氮咸認是最好及最安定之長期保存食用菌之方法(Goos, 1967; Miler and Jong, 1987; Smith and Onions, 1983)。由於使用冷凍乾燥法保存菇類菌種仍有困難,如欲有效地保存菌種原有之基因型及表現型之遺傳穩定性,則只能採用超低溫保存法保存之。經研究絕大部份之菇類能以小米粒為生長基質,10%甘油作為抗凍劑,經 1 /min 降溫速率保存在-80℃冰櫃及液態氮中,可維持相當高之存活率 (, 1988 & 1989.)。一般抗凍劑以10%甘油即可以避免冰晶的形成造成細胞之傷害,但是甘油滲透速度慢,須靜置一段時間才能完全滲入,而滲透過久對某些菌會造成毒害(Smith & Onions, 1983)。例如草菇在甘油中保存在4℃三週後,其存活率及生長速率普遍降低,即可能為甘油對草菇菌體造成毒害之結果。而 5% DMSO是相當好之抗凍劑而且滲透速度快,唯DMSO對人體毒性較大,所以較少為學者所採用,但許多菌種仍需靠此一抗凍劑來保存菌株且存活率優於甘油(Hwang, 1968; Smith & Onions, 1983)。

控制冷凍之降溫速率能使細胞外溶液凍結而細胞內不凍結(Pegg, 1976),由於擴散的原理而導致細胞逐漸脫水至細胞外結冰,以防止冰晶對細胞造成膜的破裂,形態的改變、抑制 RNA, DNA 的合成等等傷害(Calcott, 1985)。細胞質的冰點 (freezing point) 常大於-1℃,而且有超冷的現象(supercooled),即使細胞外的液體已結冰,而細胞內尚末凍結,此現象顯示細胞膜可防止外部冰晶進入超冷的內部,亦即細胞內不含有超冷的冰核 (Mazur, 1970)。然降溫速度若過於緩慢,則會因嚴重失水造成胞內毒害,但降溫速度若太快易使得細胞內結冰而刺傷細胞(Pegg, 1976; Pegg & Shell, 1984),而直接置入 -80 ℃及液態氮中保存,由於降溫速度太快阻礙保存之效果(Jong, 1987)。快速解凍可以減少解凍過程中冰晶的再形成對菌體造成傷害,故以37-45℃快速解凍可以減少解凍過程冰晶之再形成,提高存活率(Goos, 1967)。

食用菇類多數具有豐富之營養價值,其所含之蛋白質、氨基酸、維生素及礦物質之含量與種類均較一般蔬菜為高為多。彼等之栽培較容易,能利用富有纖維素之農業廢料如穀類禾稈,鋸木廠之木屑廢棄物來生產,而栽培後之廢棄培養基質,又可當做飼料、肥料或供抽取酵素及特殊成分之用,利用價值甚高,因此廣泛蒐集菇類菌株,對今後台灣新興菇的發展及其新產品之開拓,當極有助益,菌種中心成立的目的亦即除保存本土特有菌種之外,同時提供國內外各類食藥用菇菌種供國內業者及學者採用。

5.2. 菌種保存方法

菇類菌種保存方法,大致上可分為五種:繼代培養法、液體石腊覆蓋法、無菌水保存法、冷凍乾燥法、低溫保存法(表一),其中繼代培養方法是一般人常用的方法,雖操作簡便,但容易產生變異而影響其原有的優良品種;經過滅菌的液體石腊覆蓋在菌種上面,可阻隔空氣的水分散失,減緩空氣的進出,但菌體代謝仍照常進行,遺傳穩定性仍差;將菌體懸浮在無菌水上面,在冰箱冷藏可短時間保存菌種,這是較適合一般菇農實施的方法,唯同一菌株應以保存時間不超過半年為限,否則變異仍將逐年明顯;冷凍乾燥保存方法是一種不會產生變異的方法之一,一般僅適用於產孢的黴菌而言,對於其他菇類菌種,則目前荷蘭真菌保存中心(CBS)已初步試驗成功 (Tan & Stalpers, 1991),利用雙糖之trehalose為保護劑,對裂褶菌 (Schizophyllum commune) 及鬼傘 (Coprinus psychromorbidus) 冷凍乾燥後可以存活,但還不穩定,此方法仍有待更多的實驗,不過若能成功的話,則將使銷售及運輸達到相當的便利程度。

低溫保存法可分為兩種,一為 -20℃至 -135℃之間的保存,另一種為超低溫液態氮保存【溫度介於 -150(氣相) -190(液相)之間】,-20℃至-135℃之間的保存是靠冰箱冷凍保存,選擇適當的抗凍劑可保存兩三年,但由於冰箱會受到停電、機器的穩定性及開開關關溫度變化大等因素,使菌種容易受到外在因子的影響而導致死亡,因此必須時常測試其存活;而液態氮保存,不管是液相或氣相,溫度均低於-139℃,完全不受電力影響,是目前被公認世界上最佳的保存方法。食品工業發展研究所所有菇類菌種皆保存於液態氮中,除極少數比較敏感的菌株之外,其餘皆可妥善保存 (, 1988, 1989),例如木生菇中之香菇、金針菇、鮑魚菇、木耳、靈芝、伏苓等菌種保存在-80℃及液態氮時,以10%甘油、10%葡萄糖、10%蔗糖及無菌水當抗凍劑時,在10%甘油中能維持相當高的存活率;而草性菇中之洋菇及草菇於-80℃及液態氮保存,以不同抗凍劑保護,除草菇保存較差之外,不同品系的洋菇在保存上皆沒有問題(, 1989),而利用此種超低溫保存與傳統之繼代培養方式對菌種菇體形成前菌絲生長期日數長短有顯著的影響,而且若經人工栽培試驗比較其產量時,也很明顯可以看出液態氮保存的菌種有較高的產量。

5.2.1. 繼代培養法

A. 選擇適當培養基,製成斜面試管,將菌種移植生長。

B. 每一菌種最好有五至十根試管培養。

C. 每次更新培養基時,最好以適當培養基及營養條件差的培養基輪流替換,以減少因長期生長在營養成分高的培養基造成突變率增高或生理活性降低。例如夏季鮑魚菇可培養於馬鈴薯葡萄糖洋菜培養基(PDA) 及麥芽糖抽出物培養基(MEA) 或單純洋菜培養基(WA)

D. 隨時留意貯放期間是否受到污染,棉花塞試管應避免瞞的侵襲造成污染,若為螺旋試管,則應留意管口是否因濕氣而有雜菌滋生。

E. 若發現有老化、退化、污染等情形,應捨棄重新購入菌種,以免因污染或菌種活性退化而產量降低造成損失。

5.2.2. 液體石腊覆蓋法

A. 選擇營養成份較低的培養基(但也必須菌株能生長良好的培養基),將菌種移植生長,直到長滿試管。

B. 將已殺過菌的液體石腊油倒入試管內,拴上螺旋蓋子或塞入棉花塞。

C. 於室溫中或4℃以上低溫保存。

D. 保存期間應維持乾燥,以避免雜菌或昆蟲滋生。

E. 此法保存應存備而不用的心態,萬一繼代培養方法菌種污染退化或其他方法發生問題才考慮自此菌種再活化,因為石腊會阻礙生長及保存過久會老化。

5.2.3. 無菌水懸浮保存法

A. 將菌種培養於試管或培養皿上。

B. 將蒸餾水裝入三角燒瓶或試管內,殺菌備用。

C. 取菌落外圍0.5公分以內的菌絲塊,約0.5公分見方大小,丟入無菌水內。

D. 於冰箱冷藏室保存。

E. 取用時直接將菌絲塊接入適當培養基即可。

備註:可將無菌水直接倒入試管內亦可(培養皿不宜,因為太寬容易污染),不過因為培養基仍含有大量養分,菌體仍持續生長,老化現象比切塊置入無菌水還快,較不適採用。

5.2.4. 冷凍乾燥保存法

A. 將已滅過菌的半透膜(PT cellophane membrane)舖在培養基上,然後接入菌種,待菌絲長至直徑五至八公分。

B. 撕下半膜透,將菌絲移入液體培養基,以果汁機打碎。

C. 取菌絲片段懸浮液75ml加入300ml液體培養基,並以150rpm振盪培養數天。

D. 將菌絲團放入 300 μl12% skimmed milk 中,此抗凍劑中須含有糖類,如trehalose即是一種很好的保護劑,然後以每分鐘 1℃緩慢冷凍至-70℃後,於真空乾燥機中真空乾燥至含水量底於5%

E. 活化時將凍乾管打破,並將菌體懸浮於液體培養基中復水,此時可接種於洋菜培養基或直接在液體培養基中生長。

備註:存活率將隨凍乾程度而有不同,愈乾則保存期限愈長,但存活率愈低,反之含水量愈高存活率高,相對的保存期限愈短。

5.2.5. 超低溫保存法

A. 將菌種接種於小米或洋菜培養基上,待長滿後取小米或洋菜塊。

B. 將已長菌絲之小米或洋菜塊移入冷凍小管(vial)內,內含10%甘油或5%DMSO ,置於4℃或室溫下靜置兩小時,使抗凍劑完全滲透進去菌體內。

C. 以每分鐘 1℃緩慢冷凍至-70℃後,保存於-80℃或液態氮氣相中。

D. 活化時將低溫保存管取出置於3740,70%酒精浴中迅速解凍,然後取出菌體移植入適當培養基上生長。

備註:某些較敏感的菌種可以考慮於抗劑凍中再加入糖類,可提高保存效果。

表一、菌種保存方法之比較

繼代培養法

1.使用方法簡單

2.不需特別設備

1.生理活性降低

2.容易發生變異

室溫半年以內

4℃一年以內

石腊油覆蓋

1.減緩代謝反應

2.防止菌體乾燥

2.遺傳穩定性差

2.長期活性降低

一年以上

無菌水懸浮

1.操作方法簡便

2.活化步驟簡單

1.水分容易蒸發

2.適合短期保存

1015℃半年

冷凍乾燥法

1.容易運輸銷售

2.節省空間浪費

3.安全穩定性高

1.適用菌種有限

4-40

超低溫保存

1.安全穩定性高

2.保存期限很長

3.適用各種菌種

1.設備耗材昂貴

2.冰晶造成傷害

4-5 年以上

某些菌10年以上

菌種保存工作,除了保存微生物之遺傳及生理性質不變,提供鑑定上的標準菌株之外,更可利用原生質體融合及遺傳工程的技術,改良菌種,以生產高效益之產品,實為一知識及科技的寶庫。由於菌種鑑定及保存是屬於專業知識,且必須投以大量的人力及財力,故在開拓之初非常艱辛。食品工業發展研究所於民國七十一年奉經濟部之指示,成立菌種保存及研究中心 (Culture Collection and Research Center, 簡稱CCRC),十年來,無論在菌種蒐集、保存、鑑定、改良及服務工作上,已紮實了儲備國內生物科技種原的基礎。菌種之低溫保存也從原先的-80℃冷凍保存提昇至液態氮超低溫保存,使菌種保存更趨完善。

由於繼代培養、石腊油覆蓋及無菌水保存仍容易在短時間內發生老化及突變等不良情形,因而在栽培上仍建議一年以內短時間施用,而長遠來看,為了達到出菇的品質與產量上的穩定,故而建議以保存效果最佳的液態氮超低溫保存法來妥善保存優良的品種。

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